细胞凋亡测试步骤及注意事项

一、试验目的

1、掌屋细胞分裂细胞内的形态特征 2、学会用激光探针对细胞内进行时双标识来扫描正常来时细胞内、细胞分裂细胞内和囊肿细胞内的方法

二、试验基本原理

细胞内死亡根据其性质、起源及遗传学意义区分为细胞分裂和囊肿两种多种不同类型。细胞分裂普遍长期存在于生命界，在生物个体和生存环境里起着非常极其重要的用上用。它是细胞内在一定生理必要条件下一系列顺序引发事件的重新组合，是细胞内遵循一定规律自己结束生命的自主遏制流程。细胞内细胞分裂具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见细胞分裂细胞内与周围细胞内脱离触及，细胞内变园，细胞内膜向内皱缩、胞浆浓缩、溶激酶体壮大、细胞内核固缩破裂黄绿色团块突起或新月突起分布、溶激酶体和细胞内膜全面糅合将细胞内分成多个比较简单包裹的细胞分裂小体，细胞分裂小体最后被吞噬细胞内吞噬消化。在细胞分裂流程里细胞内章节物并不释放到细胞内以外，不必影响其它细胞内，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞内细胞分裂的流程里，内源性遗传物质内切激酶来时化，来时性增加。核DNA随机地在核小体的连接口腔被激酶切断，代谢为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行时琼脂糖液相，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯突起带纹）的特征。

相比较，囊肿是细胞内处于轻微损坏必要条件下引发的细胞内死亡。细胞内在囊肿现代即夺去质膜比较简单性，各种细胞内器收缩，进而质膜崩解释放出其里的章节物，引起炎症反应，囊肿流程里细胞内核DNA虽也代谢，但由于长期存在各种总长度不等的DNA片断，不可形成梯突起带纹，而黄绿色发散突起。

一些温和的损坏刺激及一些效本品可其会细胞内细胞分裂，通常这些主因在其会细胞分裂的同时，也可造成细胞内囊肿，这取决于损坏的轻微程度和细胞内本身对刺激的敏感程度。

黄杨胺酸（HT）是我国而无须研制成功的一种对急性白血球内脑癌，急性多核脑癌等有很差的效本品。深入研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内用上用2足足，即可其会HL-60细胞内细胞分裂，并表现出典型的细胞分裂特征。本试验用1μg/ml HT在体以外其会人才培养的HL-60细胞内引发细胞分裂，同时也有少数细胞内引发囊肿。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞内进行时双重颜料，可以多种不同之处细胞分裂、囊肿及正常细胞内。

细胞内膜是一抑制的生物膜，一般的生物原料如PI等不可穿过质膜。当细胞内囊肿时，质膜不比较简单，PI就进入细胞内内部，它可填充到DNA或RNA里，使囊肿细胞内纹理，细胞分裂细胞内和来时细胞内不纹理。而一些来时细胞内原料由于为极性固体，可跨膜进入来时细胞内，因而可进行时来时细胞内颜料。Hoechst33342是一种来时性激光原料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异为基础（主要为基础于A-T）酸基区），显示细胞分裂细胞内和来时细胞内。凡是看见有细胞分裂小体的细胞内都是细胞分裂细胞内。

三、试验用品

1、阴离子：黄杨胺酸（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、酸性催化液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE液相缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 2、仪器：激光成像，液相仪，液相槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、试验涂料

人早幼粒脑癌HL-60细胞内，用所含10%小牛血清的RPMI1640人才培养基在37℃，5%CO2必要条件下人才培养。

五、方法解决办法

1、黄杨胺酸诱发HL-60细胞内细胞分裂 （1）试验前约24足足，接种两花瓶HL-60细胞内，标识①、②，每花瓶所含约6ml人才培养液，分置37℃，5%CO2人才培养箱人才培养。 （2）试验前约2.5足足，当细胞内运动速度达到70%，①号花瓶重新加入黄杨胺酸200μl，使终浓度为1μg/ml，②号花瓶里重新加入同等量PBS（pH7.4）用上对照。共同放入人才培养箱里继续人才培养2.5足足。

2、Ho33342和PI双重颜料鉴别三种细胞内 （1）颜料：将花瓶里的细胞内摇匀取200μl于1.5ml的离心管里，重新加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，颜料15分钟。 （2）滴片：取一载玻片用双面胶排列成一小室，从离心管里各取以上颜料后的细胞内悬液10μl，重新加入小室内盖上盖玻片，激光镜下用紫以外诱发光，高倍镜下掩蔽，多种不同之处三种细胞内，并同样三者分之一。

六、同样事项

1、其会人才培养HL-60细胞内时间要精确； 2、激光成像下掩蔽细胞内时，由于激光易碎亡国，掩蔽时要须要快。